1. dna模板
2.对应目的基因的特异引物(在pcr反应中,新合成的dna是要接在一小段序列上才能继续按照模板dna复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是dna也可以是rna,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×pcr buffer
4.2mm dntpmix:含datp、dctp、dgtp、dttp各2mm
5.taq酶操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×pcr buffer 5μl
dntp mixl 4μl
引物1(10pm) 2μl
引物2(10pm) 2μl
taq酶(2u/μl) 1μl
dna模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddh2o至 50 μl
视pcr仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置pcr仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,pcr产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.pcr的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μllufang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。